Growth conditions influence at strutural and virulence characterístics of Candida and Streptococcus biofilms developed on in vitro models of human oral mucosa

Orientador: Altair Antoninha Del Bel CuryTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: O patógeno oportunista Candida albicans e Streptococcus do grupo Mitis formam comunidades complexas em múltiplos sítios da cavidade oral, nos quais o ambiente e a disponibilidade de nutrientes sofrem mudanças constantes. Objetivou-se estudar as características estruturais e de virulência de biofilmes de Candida albicans na presença e ausência de S. oralis crescendo sobre um modelo tri dimensional de mucosa oral humana, em diferentes condições: (1) umidade da superfície mucosa (molhada ou semi seca), (2) disponibilidade de nutrientes (suplementação do meio de cultura com BHI) e (3) morfotipo da hifa (hifa ou pseudo hifa). Para isso foram utilizados modelos tri dimensionais de mucosa oral humana formado por queratinócitos imortalizados (linhagens celulares OKF6-TERT2 ou SCC15) sobre uma matriz colágena com fibroblastos para o crescimento dos biofilmes. Estes foram infectados por Streptococcus oralis 34, e/ou Candida albicans, sendo uma cepa de referência e cepas mutantes para a formação de pseudo-hifas, pela deleção dos genes ndt80 ou tup1. A determinação do biovolume e estrutura do biofilme foram realizadas por microscopia confocal a laser, com os biofilmes sendo corados por imunofluorescência com anticorpo especifico para C. albicans e sonda para Streptococcus. Como determinante de virlência secções de tecido com 5 ?m de espessura foram coradas da mesma maneira anterior ou por hematoxilina e eosina, com o intuito de se detectar a invasão de microorganismos. O dano tecidual também foi mensurado pela liberação de lactato desicrogenase no meio de cultura. Os dados foram avaliados por análises de variâncias (ANOVA) e os procedimentos para comparações múltiplas pareadas por Bonferroni t-test, com ? = 5%. Em condições úmidas C. albicans estendeu hifas longas e entrelaçadas, formando um biofilme de superfície homogênea. Biofilmes mistos apresentaram uma estrutura estratificada, com S. oralis crescendo em contato com a mucosa e a C. albicans cobrindo a superfície bacteriana. Em condições de semi-secas a C. albicans formou densos focos de crescimento localizados a partir dos quais as hifas estenderam-se radialmente para se entrelaçarem com hifas de focos adjacentes. Em biofilmes mistos este fenômeno provocou o acúmulo focal de S. oralis co-localizado com os focos de C. albicans. Embora o biovolume do biofilme de C. albicans tenha sido significativamente maior em condições úmidas (P<0,001), houve uma invasão tecidual mínima em comparação com as condições semi-secas, na qual a barreira epitelial foi completamente destruída. A suplementação do meio de cultura, em condições semi-secas não alterou a arquitetura do biofilme, mas intensificaram o crescimento, o biovolume e a invasão/dano tecidual (P<0,001), proporcionalmente as concentrações testadas. Mutantes para a formação de pseudo-hifas formaram biofilmes defeituosos, nos quais a maioria dos S. oralis estava em contato com a superfície epitelial, abaixo das pseudo-hifas. A presença de S. oralis promoveu invasão e dano tecidual em todas as condições. Conclui-se que a umidade, a disponibilidade de nutrientes, o morfotipo da Candida e a presença de S. oralis afetam fortemente a arquitetura e virulência de biofilmes de C. albicans crescidos sobre nas mucosasAbstract: The opportunistic pathogen Candida albicans and streptococci of the Mitis group form complex communities in multiple oral sites, where the environment and nutrient availability change constantly. We aimed to study structural and virulence characteristics of Candida albicans biofilms in the presence or absence of S. oralis, growing on a three-dimensional model of human oral mucosa, under different conditions: (1) moisture of mucosal surface (wet or semi dry), (2) nutrient availability (BHI supplementation on culture media) and (3) hyphal morphotype (hyphae or pseudohyphae). For this it was used a three-dimensional model of the human oral mucosa formed by immortalized oral keratinocytes (OKF6-TERT2 or SCC15 cell lines) on a fibroblast-embedded collagenous matrix to grow biofilms. Infections were carried out using Streptococcus oralis 34, a C. albicans reference strain and pseudohyphal mutants with a homozygous deletion of the ndt80, or tup1 gene. Determination of biofilm biovolume and structure was done by confocal scanning laser microscopy with biofilms stained by immunofluorescence using an anti-Candida antibody and a Streptococcus probe. As determinant of virulence, 5-?m-thick tissue sections were stained same way or with hematoxylin and eosin in order to detect invasion of microorganisms. Also tissue damage was measured by lactate dehydrogenase release in the culture media. Statistical analyses were performed using SigmaPlot 12 software at 5% significance level. Data were evaluated by analysis of variance (ANOVA) and when statistical significances were found, all pairwise multiple comparison procedures were performed with Bonferroni t-test, with ? = 5%. Under wet conditions C. albicans extended long intertwined hyphae, forming a homogeneous surface biofilm. Mixed biofilms had a stratified structure, with S. oralis growing in close contact to the mucosa and C. albicans growing on the bacterial surface. Under semi-dry conditions, C. albicans formed localized foci of dense growth from which hyphae extended radially to intertwine with hyphae from adjacent foci. In mixed biofilms this promoted focal growth of S. oralis co-localizing with C. albicans. Although Candida biofilm biovolume was significantly greater under wet conditions (P<0.001), there was minimal tissue invasion compared to semidry conditions where the epithelial barrier was completely destroyed. Supplementing the infection medium with nutrients under semidry conditions did not change the biofilm architecture but intensified focal growth and increased biofilm biovolume and tissue invasion/damage (P<0.001), proportionally to the tested concentrations. Pseudohyphal mutants formed defective mixed biofilms, with most S. oralis in contact with the epithelial surface, below the pseudohyphal mass. Interestingly, the presence of S. oralis promoted fungal invasion and tissue damage under all conditions. Moisture, nutrient availability, hyphal morphotype and presence of S. oralis strongly affect architecture and virulence of mucosal fungal biofilmsDoutoradoProtese DentalDoutora em Clínica Odontológic

In vitro evaluation of two resins-based denture soft lininers modified by chlorhexidine incorporation

Resinas macias para reembasamento de próteses são largamente utilizadas após cirurgias para estabilizarem a prótese e condicionarem o tecido, aguardando a completa cicatrização. É importante que o material não seja facilmente colonizado por biofilme oral e se possível, evite a contaminação do sítio cirúrgico. Objetivou-se avaliar o efeito da incorporação de clorexidina às resinas acrílicas macias para o reembasamento de próteses totais, através de análises de liberação, citotoxicidade e efeito inibitório de um biofilme de C. albicans. Foram confeccionados corpos de provas (CDPs) com as resinas Trusoft e Coe-soft, com incorporação de 0%, 0,5%, 1,0% e 2,0% de clorexidina, totalizando 8 grupos. A liberação de clorexidina foi avaliada através da mensuração da mudança na densidade óptica da solução de armazenamento, na qual ficaram imersos os CDPs, por espectrometria UV, a cada 48 horas, durante 40 dias. A citotoxicidade celular foi avaliada em fibroblastos (linhagem L929), que ficaram 24 horas em contato com meio de cultura no qual os CDPs ficaram previamente imersos, pela técnica de absorção de corante vermelho neutro após 24, 48 e 72 horas e semanalmente até o 28 dia. E, por fim, a atividade antifúngica contra a C. albicans (ATCC 10231) foi avaliada de duas maneiras: (1) teste de difusão em ágar, no qual os CDPs foram colocados em placas de BHI previamente inoculadas com C. albicans, com medição do halo de inibição após 48 horas de incubação a 37C; (2) a avaliação da inibição da formação de um biofilme de C. albicans sobre a superfície dos CDPs pela quantificação por metil tetrazólio (MTT) a cada 48 horas, durante 22 dias, com leitura feita em espectrofotômetro de UV. Os dados obtidos foram inseridos no programa SigmaStat (versão 3.1, USA) para realizar as análises estatísticas. As diferenças estatísticas foram determinadas por análises de variâncias do tipo ANOVA e todos os procedimentos para comparações múltiplas pareadas foram feitos utilizando-se o método Holm-Sidak, com nível de significância global igual a 0,05. A clorexidina adicionada às resinas testadas foi capaz de ser liberada para o meio de armazenagem, proporcionalmente à quantidade de clorexidina incorporada, porém com diferentes cinéticas de liberação entre as resinas, visto que a Trusoft libera até 71% do total de clorexidina liberada nas primeiras 48 horas e a Coe-soft, até 44%. Ambas as resinas com incorporação de clorexidina apresentaram efeito citotóxico adicional, se comparadas às resinas sem clorexidina, porém para a Coe-soft não houve diferença estatística dos valores, apenas para a Trusoft (p<0,001). Ocorreu formação de halo de inibição proporcionalmente às concentrações de resinas adicionadas, com maiores halos para a resina Trusoft (p<0,001), e sem formação de halo para as resinas sem clorexidina; a inibição da formação de biofilme, realizada somente com a resina Coe-soft, mostrou total inibição durante 8, 12 e 16 dias, para a incorporação de 0,5%, 1,0% e 2,0% respectivamente, sendo uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,001) em relação à resina sem incorporação de clorexidina, que não apresentou inibição do biofilme.Denture soft lining materials are widely used after dental surgeries, tissue conditioning and stabilization of prostheses, until the complete tissue healing. It is important that this material not became easily colonized by oral biofilm and if possible, avoid contamination of the surgical site. The aim of this study was to evaluate the effect of chlorhexidine incorporation into resin-based soft denture lining material, considering the drug release analysis, cytotoxicity and C. albicans biofilm inhibition. Specimens were done using Trusoft and Coe-soft, incorporating 0%, 0.5%, 1.0% and 2.0% of chlorhexidine, totaling eight groups. The chlorhexidine release was evaluated through the measurement of change in optical density of the storage solution, which the specimens were immersed, by UV spectrometry, after every 48 hours for 40 days. The cellular cytotoxicity was evaluated in fibroblasts (strain L929), which were 24 hours in contact with culture medium, in which the specimens were previously immersed, the technique of neutral red dye uptake was used after 24, 48 and 72 hours and weekly until 28th day. Finally, the antifungal activity against C. albicans (ATCC 10231) was evaluated by two different ways: (1) agar diffusion test, in which the specimens were placed over the top of BHI agar plates previously inoculated with C. albicans, and the measurement of inhibition zone was done after 48h of incubation at 37C, (2) C. albicans biofilm inhibition over the specimens surface, which was mensured after every each 48 hours of biofilm and specimens co-incubation, by methyl tetrazolium (MTT), in UV/vis spectrophotometer, during 22 days. Data were analyzed with the SigmaStat software (version 3.1, USA). Statistical differences were determined by analysis of variance ANOVA and all procedures for multiple paired comparisons were made using the Holm-Sidak method, with overall significance level of 0.05. The chlorhexidine added to both resins, Trusoft and Coe-soft, can be released to the storage medium, with a dose-related effect, however the resins presented different release kinetics, since the Trusof released up to 71% of the total amount of the chlorhexidine released within the first 48 hours and Coe-soft release only up to 44%, considering the citotoxic effect, both chlorhexidine incorporated resins showed some extra cytotoxic effect, if compared to resins without chlorhexidine, but for Coe-soft no statistical difference of values was founded, only for Trusoft (p<0.001); considering the C. albicans inhibition, the agar diffusion test values were dose-related for both resins, however with bigger inhibition zones for Trusoft (p<0.001), and without any inhibition for the resins without clorexidine. For the C. albicans biofilm inhibition test, performed only with Coe-soft resin, it was verified a complete inhibition at 8, 12 and 16 days for the incorporation of 0.5%, 1.0% and 2.0% of clorexidine respectively, a statistically significant decrease (p<0.001) if compared to the resin without incorporation of chlorhexidine, which showed no inhibitory effect over the biofilm formation

Candida albicans biofilms and MMA surface treatment influence the adhesion of soft denture liners to PMMA resin

The effect of Candida albicans biofilms and methyl methacrylate (MMA) pretreatment on the bond strength between soft denture liners and polymethyl methacrylate (PMMA) resin was analyzed. Specimens were prepared and randomly divided with respect to PMMA pretreatment, soft liner type (silicone-based or PMMA-based), and presence or absence of a C. albicans biofilm. Samples were composed of a soft denture liner bonded between two PMMA bars. Specimens (n = 10) were incubated to produce a C. albicans biofilm or stored in sterile PBS for 12 days. The tensile bond strength test was performed and failure type was determined using a stereomicroscope. Surface roughness (SR) and scanning electron microscopy (SEM) analysis were performed on denture liners (n = 8). Highest bond strength was observed in samples containing a silicone-based soft liner and stored in PBS, regardless of pretreatment (p &lt; 0.01). Silicone-based specimens mostly underwent adhesive failures, while samples containing PMMA-based liners predominantly underwent cohesive failures. The silicone-based specimens SR decreased after 12 days of biofilm accumulation or PBS storage, while the SR of PMMA-based soft liners increased (p &lt; 0.01). The PMMA-based soft liners surfaces presented sharp valleys and depressions, while silicone-based specimens surfaces exhibited more gentle features. In vitro exposure to C. albicans biofilms reduced the adhesion of denture liners to PMMA resin, and MMA pretreatment is recommended during relining procedures.616